Leistungsstarkes Mikroskop erfasst Motorproteine ​​in beispielloser Detailgenauigkeit

May 01, 2023

Amanda Heidt ist eine freiberufliche Autorin und Redakteurin in Moab, Utah.

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Illustration molekularer Motoren namens Kinesine auf einem Mikrotubulus.Quelle: Graham Johnson, Ron Vale/HHMI

Fast sobald es hochauflösende Mikroskope gab, wiesen Wissenschaftler sie auf molekulare Motoren namens Kinesine hin. Diese Proteine, angetrieben durch den molekularen Treibstoff ATP, steuern entscheidende Prozesse wie Zellteilung, Zellsignalisierung und intrazellulären Transport, indem sie Fracht entlang Proteinautobahnen, sogenannten Mikrotubuli, befördern. Forscher wollten schon lange verstehen, wie diese Motoren funktionieren, doch um sie sichtbar zu machen, mussten Wissenschaftler sie verlangsamen oder in vereinfachten In-vitro-Systemen isolieren.

In gleichzeitig in Science veröffentlichten Arbeiten haben nun zwei unabhängig voneinander arbeitende Teams ein hochauflösendes Tool namens MINFLUX verwendet, um den Motor nahezu in Echtzeit bei physiologisch relevanten ATP-Konzentrationen zu untersuchen. In der ersten Arbeit unter der Leitung von Stefan Hell, dem Erfinder von MINFLUX, der gemeinsam am Max-Planck-Institut (MPI) für multidisziplinäre Wissenschaften in Göttingen und am MPI für medizinische Forschung in Heidelberg, beide in Deutschland, tätig ist, wurde ein neues Instrumentendesign zur Verfolgung verwendet das Protein in 3D und enthüllt Details über seine Bewegung1. Die zweite Studie, die vom Biophysiker Jonas Ries am Europäischen Labor für Molekularbiologie in Heidelberg geleitet wurde, zeigte zum ersten Mal, dass MINFLUX in der Lage ist, Kinesin sogar inmitten der Hektik lebender Zellen zu verfolgen2.

„Diese Technologie erfordert viele verschiedene Dinge, um zu funktionieren, und es macht Spaß zu sehen, wie all diese Dinge zusammenkommen“, sagt Michelle Digman, eine biomedizinische Ingenieurin an der University of California in Irvine, die Bildgebungsstrategien entwickelt, an beidem aber nicht beteiligt war Studie. „Es schien ein Machbarkeitsnachweis zu sein, der zeigte, dass sie Kinesin sehr genau verfolgen können. Und wenn man das Lebendzellsystem hat, ist das noch spektakulärer.“

Kurz nach der Entdeckung des Proteins im Jahr 1985 begannen Forscher mit der Ausarbeitung der Grundlagen der Bewegung von Kinesin, doch das Aufkommen von hochauflösenden Werkzeugen brachte eine neue Detailebene mit sich. Im Jahr 2004 verwendeten Forscher eine Technik namens FIONA (Fluoreszenzbildgebung mit einer Genauigkeit von einem Nanometer), um zu zeigen, dass Kinesin, das wie ein hoher, gedrehter Stiel mit übergroßen Schuhen aussieht, auf seiner Mikrotubuli-Bahn „Hand über Hand“ läuft und dabei seine Mikrotubuli bewegt Füße in einer Bewegung, die den Händen eines Kindes ähnelt, wenn sie ein Klettergerüst überqueren3. Doch obwohl FIONA eine außergewöhnliche räumliche Auflösung lieferte, mussten die Wissenschaftler das ATP rationieren, um das Protein ausreichend zu verlangsamen, um es untersuchen zu können. Im letzten Jahrzehnt markierten Forscher Kinesin mit Kügelchen aus Germanium4 oder Gold5, um es zu verfolgen, aber diese relativ sperrigen Markierungen lassen Zweifel daran aufkommen, wie gut die Methoden den gesamten Bewegungsbereich des Proteins rekapitulieren.

Als Hell und sein Team 20166 MINFLUX einführten, sah er darin einen Fortschritt gegenüber seinem Vorgänger, der STED-Mikroskopie (Stimulated Emission Depletion), für die Hell 2014 den Nobelpreis für Chemie erhielt. STED verwendet einen donutförmigen „Depletion“-Laser, der einem Anregungslaser überlagert ist, um die Fluoreszenzfläche effektiv unter die herkömmliche Beugungsgrenze von Licht (ca. 250 Nanometer) zu verkleinern. Im Gegensatz dazu verwendet MINFLUX einen Donut-förmigen Laser, um in seinem Zentrum einen Punkt ohne Fluoreszenzintensität zu erzeugen. Durch die Bewegung dieses Lasers können Forscher die Position eines fluoreszierenden Moleküls mit nahezu physiologischer Geschwindigkeit lokalisieren.

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In der neuen Studie1, die im März veröffentlicht wurde, testete Hells Gruppe eine Version von MINFLUX, die lineare Laser in zwei Richtungen in der Brennebene schnell hintereinander pulsiert und das Protein lokalisiert, indem sie herausfindet, wo die überlappenden Fluoreszenzintensitäten am niedrigsten sind. Durch die Kombination mehrerer Messungen konnten die Forscher Spuren erstellen, die zeigen, wohin sich das Molekül entlang des Mikrotubulus bewegt, ähnlich einer App, die den Weg eines Läufers kartiert.

Obwohl der neue MINFLUX nicht viel effektiver war als die vorherige Version, konnte sein Team laut Hell daraus eine Gehgeschwindigkeit für Kinesin von 550 Nanometern pro Sekunde und eine Schrittlänge von 16 Nanometern bei ähnlichen ATP-Konzentrationen ableiten kommt in lebenden Zellen vor. Durch die Markierung und Verfolgung verschiedener Teile des Proteins zeigte das Team außerdem, dass jeder Schritt aus zwei 8-Nanometer-Unterschritten besteht und dass sich der Stiel eines Kinesins bei seiner Bewegung dreht, was zu einer Vorwärtsbewegung führt, die sich leicht nach rechts dreht. Die Autoren fanden außerdem heraus, dass ATP aufgenommen wird, wenn nur ein Fuß an den Mikrotubulus gebunden ist, aber verbraucht wird, wenn beide Füße gebunden sind – was zuvor widersprüchliche Ergebnisse auflöste7,8.

Ries und sein Team näherten sich der Kinesin-Bewegung aus einer anderen Perspektive. Sie verwendeten ein kommerzielles MINFLUX-Instrument, das von Abberior, einem von Hell mitbegründeten Göttinger Unternehmen, entwickelt wurde, um das Protein in lebenden Zellen zu verfolgen. Die überfüllte und sich ständig verändernde zelluläre Umgebung führte dazu, dass die Gruppe am Ende weniger Spuren hatte, aber sie war in der Lage, Ausweichen, Abwürgen und Sprünge von einem Mikrotubulus zum anderen zu erfassen – alles Bemühungen des Proteins, Hindernisse zu umgehen, die normalerweise nicht vorkommen in gereinigten Proben gesehen. „Ansonsten sehen wir im Großen und Ganzen das Gleiche: ähnliche Gehgeschwindigkeiten, gleiche Schrittgrößen“, sagt Ries. „Und es war schön, diese erstmals in der lebenden Zelle messen zu können.“

William Hancock, ein biomedizinischer Ingenieur an der Pennsylvania State University im State College, der Kinesin untersucht, aber an keiner der beiden Studien beteiligt war, nennt die Studien „ziemlich unglaublich“. Er stellt fest, dass die Ergebnisse größtenteils mit früheren Arbeiten übereinstimmen, die fast alle in vitro unter Verwendung gereinigter Motorproteine ​​durchgeführt wurden. „Dort erhalten wir unsere sehr konkreten Antworten, aber es ist schön, Rückschlüsse auf das Innere von Zellen ziehen zu können. Es ist wirklich eine Meisterleistung.“

Dennoch ist Hell klar, dass MINFLUX „noch nicht am Limit seiner Leistungsfähigkeit ist“. Nachdem MINFLUX eine räumliche Auflösung im Subnanometerbereich erreicht hat, sei die zeitliche Leistung ein Bereich, in dem sich MINFLUX noch verbessern könne. Beide Gruppen arbeiteten mit ATP-Konzentrationen von bis zu einem Millimolar, die durchschnittliche Zelle enthält jedoch mehr als viermal so viel.

Um unter diesen Bedingungen eine zeitliche Echtzeitauflösung zu erreichen, sind bessere Trackingsysteme erforderlich, sagt Luke Lavis, ein organischer Chemiker am Janelia Research Campus des Howard Hughes Medical Institute in Ashburn, Virginia, der die in Ries‘ Studie verwendeten Farbstoffe entwickelt hat. „Diese Revolution in der hochauflösenden Bildgebung macht, wenn ich das so sagen kann, deutlich, dass viele der Etikettierungs- und Befestigungsstrategien, die wir verwendet haben, groß sind“, sagt er. „Der Traum von uns allen besteht darin, ein kleines Molekül Fluorophor an einer bestimmten Stelle eines Proteins anbringen zu können, wo der Linker nur aus ein paar Atomen besteht.“ Neue Werkzeuge wie die Erweiterung des genetischen Codes, bei der synthetische Aminosäuren in Proteine ​​eingebaut werden, um die Markierung zu erleichtern, gehen in diese Richtung, fügt er hinzu, aber „sie sind noch lange nicht schlüsselfertig“.

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Solche Fortschritte könnten vielfältige Forschungsmöglichkeiten eröffnen, insbesondere wenn sie es Forschern ermöglichen, mehrere Proteine ​​oder mehrere Stellen in Proteinen gleichzeitig zu verfolgen. In diesem Jahr stellten Forscher ein Tool namens RESI (Resolution Enhancement by Sequential Imaging) vor, das genau darauf abzielt9. RESI kann benachbarte Kopien desselben Zielmoleküls mit unterschiedlichen Markierungen markieren, sodass Wissenschaftler zwischen Molekülen unterscheiden können, die weniger als einen Nanometer voneinander entfernt sind. Obwohl RESI derzeit nur an festen oder stationären Molekülen arbeitet, könnte die Kombination seiner Erkenntnisse mit MINFLUX-Tracking-Daten zu nicht fixierten Kopien ergänzende Erkenntnisse über die Anordnung und Bewegung eines Proteins liefern.

Ries interessiert sich für die Untersuchung anderer Motorproteine ​​und wandte in einem ergänzenden Experiment, das er in seiner Arbeit2 beschreibt, MINFLUX auf das Muskelkontraktionsprotein Myosin an. Im Jahr 2019 war Lavis Mitbegründer eines Unternehmens, das die Verfolgung einzelner Moleküle für die Arzneimittelentwicklung nutzt. Andere Wissenschaftler haben alles von Transkriptionsfaktoren und DNA-bindenden Proteinen bis hin zu Kohäsin und anderen molekularen Motoren als Ziele für zukünftige Studien vorgeschlagen.

Haley Marks, biomedizinische Ingenieurin und Projektwissenschaftlerin am California NanoSystems Institute an der University of California, Los Angeles, sagt jedoch, dass es einige Zeit dauern wird, bis MINFLUX zu einem wirklich zugänglichen und erschwinglichen „Plug-and-Play“-System wird. In der Zwischenzeit, so schlägt sie vor, könnte MINFLUX der breiteren Gemeinschaft zugute kommen, indem es zu virtuellen Super-Resolution-Tools beiträgt. Diese Algorithmen der künstlichen Intelligenz trainieren anhand großer Sammlungen von Mikroskopiebildern, um zu lernen, wie man aus herkömmlichen Mikroskopbildern hochauflösende Bilder erstellt. Die resultierenden Daten, sagt Marks, „sind für Menschen, die sich kein Multimillionen-Dollar-Mikroskop leisten können, viel leichter zugänglich“.

doi: https://doi.org/10.1038/d41586-023-01906-0

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